一、光學顯微鏡

光學顯微鏡是一種精密的光學儀器。當前使用的顯微鏡由一套透鏡配合，因而可選擇不同的放大倍數對物體的細微結構進行放大觀察。普通光學顯微鏡通常能將物體放大 1500～2000 倍(zui大的分辨力為 0.2μm)。

（一）光學顯微鏡的基本結構（附圖1）

1．光學部分 包括目鏡、物鏡、聚光器和光源等。

（1）目鏡 通常由兩組透鏡組成，上端的一組又稱為“接目鏡”，下端的則稱為“場鏡”。兩者之間或在場鏡的下方裝有視場光闌（金屬環狀裝置），經物鏡放大后的中間像就落在視場光闌平面上，所以其上可加置目鏡測微尺。在目鏡上方刻有放大倍數，如 10×、20×等。按照視場的大小，目鏡可分為普通目鏡和廣角目鏡。有些顯微鏡的目鏡上還附有視度調節機構，操作者可以對左右眼分別進行視度調整。另有照相目鏡(NFK)可用于拍攝。

（2）物鏡 由數組透鏡組成，安裝于轉換器上，又稱接物鏡。通常每臺顯微鏡配備一套不同倍數的物鏡，包括：①低倍物鏡：指 1×～6×；
            ②中倍物鏡：指 6×～25×；
            ③高倍物鏡：指 25×～63×；④油浸物鏡：指 90×～100×。
     其中油浸物鏡使用時需在物鏡的下表面和蓋玻片的上表面之間填充折射率為 1.5 左右的液體（如香柏油等），它能顯著地提高顯微觀察的分辨率。其他物鏡則直接使用。觀察過程中物鏡的選擇一般遵循由低到高的順序，因為低倍鏡的視野大，便于查找待檢的具體部位。顯微鏡的放大倍數，可粗略視為目鏡放大倍數與物鏡放大倍數的乘積。

（3）聚光器 由聚光透鏡和虹彩光圈組成，位于在載物臺下方。聚光透鏡的功能是將光線聚焦于視場范圍內；透鏡組下方的虹彩光圈可開大縮小，以控制聚光器的通光范圍，調節光的強度，影響成像的分辨力和反差。使用時應根據觀察目的，配合光源強度加以調節，得到*成像效果。

（4）光源 較早的普通光學顯微鏡借助鏡座上的反光鏡，將自然光或燈光反射到聚光器透鏡的中央作為鏡檢光源。反光鏡是由一平面和另一凹面的鏡子組成。不用聚光器或光線較強時用凹面鏡，凹面鏡能起會聚光線的作用；用聚光器或光較弱時，一般都用平面鏡。新近出產的顯微鏡一般直接在鏡座上安裝光源，并有電流調節螺旋，用于調節光照強度。光源類型有鹵素燈、鎢絲燈、汞燈、熒光燈、金屬鹵化物燈等。

        顯微鏡的光源照明方法分為兩種：透射型與反射(落射)型。前者是指光源由下而上通過透明的鏡檢對象；反射型顯微鏡則是以物鏡上方打光到(落射照明)不透明的物體上。

2. 機械部分 包括鏡座、鏡柱、鏡壁、鏡筒、物鏡轉換器、載物臺和準焦螺旋等。
（1）鏡座 基座部分，用于支持整臺顯微鏡的平穩。
（2）鏡柱 鏡座與鏡臂之間的直立短柱，起連接和支持的作用。
（3）鏡臂 顯微鏡后方的弓形部分，是移動顯微鏡時握持的部位。有的顯微鏡在鏡臂與鏡柱之間有一活動的傾斜關節，可調節鏡筒向后傾斜的角度，便于觀察。
（4）鏡筒 安裝在鏡臂先端的圓筒狀結構，上連目鏡，下連接物鏡轉換器。顯微鏡的標準筒長為 160 mm，此數字標在物鏡的外殼上。
（5）物鏡轉換器 鏡筒下端的可自由旋轉的圓盤，用于安裝物鏡。觀察時通過轉動轉換器來調換不同倍數的物鏡。
（6）載物臺 鏡筒下方的平臺，中央有一圓形的通光孔。用于放置載玻片。載物臺上裝有固定標本的彈簧夾，一側有推進器，可移動標本的位置。有些推動器上還附有刻度，可直接計算標本移動的距離以及確定標本的位置。
（7）準焦螺旋 裝在鏡臂或鏡柱上的大小兩種螺旋，轉動時可使鏡筒或載物臺上下移動，從而調節成像系統的焦距。大的稱為粗準焦螺旋，每轉動一圈，鏡筒升降 10mm；小的為細準焦螺旋，轉動一圈可使鏡筒僅升降 0.1mm。一般在低倍鏡下觀察物體時，以粗準焦螺旋迅速調節物像，使之位于視野中。在此基礎上，或在使用高倍鏡時，用細準焦螺旋微調。必須注意，一般顯微鏡裝有左右兩套準焦螺旋，作用相同，但切勿兩手同時轉動兩側的螺旋，防止因雙手力量不均產生扭力，導致螺旋滑絲。

（二）普通光學顯微鏡的基本成像原理

光線→（反光鏡）→遮光器→通光孔→鏡檢樣品（透明）→物鏡的透鏡（*次放大成倒立實像）→鏡筒→目鏡（再次放大成虛像）→眼。

（三）普通光學顯微鏡的使用過程

1．鏡檢前的準備 室內應清潔而干燥，實驗臺臺面水平，穩固無震動，顯微鏡附近不應放置腐蝕性的試劑。從顯微鏡柜或鏡箱內取出顯微鏡時，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩地取出，放置在實驗臺桌面上，置于操作者左前方，距實驗臺邊緣約10cm，鏡臂朝自己，鏡筒朝前。實驗臺右側放繪圖用具。

2．調節光源 如需利用外置光源，宜采用散射的自然光或柔和的燈光。直射的太陽光會對觀察者的眼睛造成傷害。轉動轉換器，使低倍鏡正對通光孔，將聚光器上的虹彩光圈開到zui大，觀察目鏡中視野亮度，同時調節反光鏡角度，使光照達到zui明亮zui均勻。自帶光源的顯微鏡，可通過調節電流旋鈕來調節光照的強弱。

3．裝置待檢玻片 將待觀察的樣品制作成臨時或*裝片，放在載物臺上，用彈簧夾固定，有蓋玻片的一面朝上。移動推進器，調節待檢樣品至通光孔的中心。

4．低倍鏡觀察 將低倍鏡對準通光孔，緩緩轉動粗準焦螺旋，將物鏡與裝片的距離調至zui近。注意不要壓碎蓋玻片。通過目鏡觀察，同時用粗準焦螺旋緩慢調節，直至物像出現，再用細準焦螺旋微調，同時調節光源亮度與虹彩光圈的大小，使物像達到zui清晰的程度。并利用推進器把需要進一步放大觀察的部分移至視野中央。如果使用雙筒目鏡，應在觀察前先調整雙筒距離，使兩眼視場合并。

5．高 倍鏡觀察 轉動轉換器，選 擇較高倍數的物鏡，用 細準焦螺旋調節焦距，到 物像清晰為止。

6．油鏡觀察 油浸物鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離）很短，一般在 0.2 mm 以內，且一般光學顯微鏡的油浸物鏡沒有“彈簧裝置”，因此使用油浸物鏡時，調焦速度必須放慢，避免壓碎玻片，并使物鏡受損。
（1）在低倍鏡下找到觀察目標，中、高倍鏡下逐步放大，將待觀察部位置于視野中央，調節光源和虹彩光圈，使通過聚光器的光亮達到zui大。
（2）轉動粗準焦螺旋，將鏡筒上旋（或將載物臺下降）約 2 cm，加一小滴香柏油于玻片的鏡檢部位上。
（3）將 粗準焦螺旋緩緩轉回，同 時注意從側面觀察，直 至油鏡浸入油滴，鏡 頭幾乎與標本接觸。
（4）從目鏡中觀察，用細準焦螺旋微調，直至物象清晰。
（5）鏡檢結束后，將鏡頭旋離玻片，立即清潔鏡頭。一般先用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油滴。再用擦鏡紙蘸少許(C2H5)20酒精混合液（2：3），擦去殘留油跡，zui后再用干凈的擦鏡紙擦凈（注意向一個方向擦拭）。

7．還原顯微鏡 關閉內置光源并拔下電源插頭，或使反光鏡與聚光器垂直。旋轉物鏡轉換器，使物鏡頭呈八字形位置與通光孔相對。再將鏡筒與載物臺距離調至zui近，降下聚光器。罩上防塵罩，將顯微鏡放回柜內或鏡箱中。

二、幾種特殊的光學顯微鏡

（一）暗視野顯微鏡

        暗視野顯微鏡不具備觀察物體內部的細微結構的功能，但可以分辨 0.004μm 以上的微粒的存在和運動。因而常用于觀察活細胞的結構和細胞內微粒的運動等。暗視野顯微鏡的基本原理是丁達爾效應。當一束光線透過黑暗的房間，從垂直于入射光的方向可以觀察到空氣里出現的一條光亮的灰塵“通路”，這種現象即丁達爾效應。暗視野顯微鏡在普通的光學顯微鏡上換裝暗視野聚光鏡后，由于該聚光器內部拋物面結構的遮擋，照射在待檢物體表面的光線不能直接進入物鏡和目鏡，僅散射光能通過，因而視野是黑暗的。操作者通過目鏡觀察到的，是檢物體的衍射光圖像（附圖12）。

暗視野顯微鏡的基本使用方法如下：

1．安裝暗視野聚光器（或用厚實的黑紙片制成遮光板，放在普通顯微鏡的聚光器下方，也能得到暗視野效果）。
2．選用強光源，一般用顯微鏡燈照明，以防止直射光線進入物鏡。
3．在聚光器和玻片之間加一滴香柏油，避免照明光線于聚光鏡上進行全反射，達不到被檢物體，而得不到暗視野照明。
4．進行中心調節，即水平移動聚光器，使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴格位于一直線上。升降聚光器，將聚光鏡的焦點（圖 2 中圓錐光束的頂點）對準待檢物。
5．選用與聚光器相應的物鏡，調節焦距，按普通顯微鏡的方法操作。

（二）體視顯微鏡

體視顯微鏡又稱實體顯微鏡或解剖鏡，其成像為正立三維的空間影像，并具有立體感強、成像清晰寬闊、長工作距離（通常為 110 mm）以及連續放大觀看等特點。生物學上常用于解剖過程中的實時觀察（附圖 13）。

普通光學顯微鏡的光源為平行光，因而形成的是二維平面影像；而體視顯微鏡采用雙通道光路，雙目鏡筒中的左右兩光束具有一定的夾角體視角（一般為 12o15o），因而能形成三維空間的立體圖像。體視顯微鏡與普通光學顯微鏡的使用方法相近，但更為便捷。二者的主要區別在于：

1. 體視顯微鏡的鏡檢對象可不必制作成裝片。
2. 體視顯微鏡載物臺直接固定在鏡座上，并配有黑白雙面板或玻璃板，操作者可根據鏡檢的對象和要求加以選擇。
3. 體視顯微鏡的成像是正立的，便于解剖操作。
4. 體視顯微鏡的物鏡僅一只，其放大倍數可通過旋轉調節螺旋連續調節。

（三） 熒光顯微鏡

熒光顯微鏡是利用細胞內物質發射的熒光強度對其進行定性和定量研究的一種光學工具。細胞內的熒光物質物質有兩類，一類直接經紫外線照射后即可發熒光，如葉綠素等；另有一些物質本身不具這一性質，但如果以特定的熒光染料或熒光抗體染色，經紫外線照射后亦可發熒光（附圖 1-4）。

熒光顯微鏡的原理為利用一個高發光效率的點光源（如超高壓汞燈），經 過濾色系統發出一定波長的光(如紫外光3650λ 或紫藍光4200λ)作為激發光，激發標本內的熒光物質發射出各色的熒光后，再通過物鏡后面的阻斷(或壓制)濾光片的過濾，zui后經由目鏡的放大作用加以觀察。阻斷濾光片的作用有二：一是吸收和阻擋激發光進入目鏡以免干擾熒光和損傷眼睛；二是選擇并讓特定的熒光透過，表現出專一的熒光色彩。

熒光顯微鏡按照光路原理可分為兩種：

1．透射式熒光顯微鏡 較為舊式的熒光顯微鏡，其激發光源通過聚光鏡穿過標本材料來激發熒光。其優點是低倍鏡時熒光強，而缺點是隨放大倍數增加其熒光減弱。所以它僅適用于觀察較大的標本材料。
2．落射式熒光顯微鏡 激發光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡(附圖 1-5)。

光路中需加上一個雙色束分離器（分色鏡），它與光軸呈 45o 角，激發光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發光同時進入物鏡，返回到雙色束分離器，使激發光和熒光分開，殘余激發光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應產物的需要。此種熒光顯微鏡的優點是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數愈大熒光愈強。

（四）相差顯微鏡

          相差顯微鏡是能將光通過物體時產生的相位差（或光程差）轉變為振幅（光強度）變化的顯微鏡。主要用于觀察活細胞、不染色的組織切片或缺少反差的染色標本。人眼只能鑒別可見光的波長（顏色）和振幅的變化，不能鑒別相位的變化。而大多數生物標本高度透明，光波通過后振幅基本不變，僅存在相位的變化。相差顯微鏡基本把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了 1/4λ（波長），如果再增加或減少 1/4λ，則光程差變為 1/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減下，提高反差（見圖 6）。

從結構上看，相差顯微鏡與普通光學顯微鏡不同之處在于：

1．環形光闌具有環形開孔的光闌，安裝在光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標本上。
2．相位板相差顯微鏡在物鏡內部增加了涂有氟化鎂的相位板，作用是將直射光或衍射光的相位推遲 1/4λ。相板上有兩個區域，直射光通過的部分叫“共軛面”，衍射光通過的部分叫“補償面”。相位板按工作效果分為兩種類型：

（1）A+相板：將直射光推遲 1/4λ，兩組光波合軸后光波疊加，振幅加大，標本結構比周圍介質更加明亮，形成亮反差（或稱負反差）。
（2）B+相板：將衍射光推遲 1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，標本結構比周圍介質更加暗淡，形成暗反差（或稱正反差）。帶有相板的物鏡叫相差物鏡，常在物鏡外殼上標以“Ph”字樣。

3．合軸調節望遠鏡

        相差顯微鏡配備有一個合軸調節望遠鏡（在外殼上標有“CT”符號），用于調節環狀光闌的像與相板共軛面*吻合，以便實現對直射光和衍射光的特殊處理。使用時撥去一側目鏡，插入合軸調節望遠鏡，調節合軸調節望遠鏡的焦點，視野中會呈現兩個圓環，分別是明亮的環狀光闌圓環與較暗的相板上共軛面圓環。再轉動聚光器上的環狀光闌的兩個調節螺旋，使兩環*重疊。如明亮的光環過小或過大，可調節聚光器的升降旋鈕，使兩環*吻合。如果聚光器已升到zui高點或降到zui低點而仍不能矯正，說明玻片太厚了，應更換。調好后即可取下合軸調節望遠鏡，換回目鏡。

4．綠色濾光片

        用于調整光源的波長。照明光線的波長不同，會引起相位的變化，為了獲得良好的相差效果，相差顯微鏡要求使用波長范圍比較窄的單色光，通常是用綠色濾光片來調整。相差顯微鏡的使用步驟如下：

① 根據待檢標本的性質及要求，挑選適合的相差物鏡。
② 將標本玻片放到載物臺上，進行光軸中心的調整。
③ 使用合軸調節望遠鏡，調 整環狀光闌與相板上的共軛面圓環*重疊吻合后，換回目鏡。在觀察過程中，每次更換物鏡倍數時，必須重新進行環狀光闌與相板共軛面圓環吻合的調整。
④ 加綠色濾光片，按普通光學顯微鏡的操作步驟進行觀察。

（五）倒置顯微鏡

        倒置顯微鏡的結構和普通顯微鏡基本相同，只不過物鏡與照明系統位置交換，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上。主要用于觀察培養的活細胞，需配制相差物鏡。

（六）偏光顯微鏡

偏光顯微鏡可用于檢測具有雙折射性的物質，如染色體、膠原、纖維絲等（附圖 1-7）

和普通顯微鏡不同的是：

① 偏光顯微鏡光源前配備偏振鏡（起偏器），使進入顯微鏡的光線為偏振光。
② 鏡筒中有檢偏振鏡（檢偏器，一個偏振方向與起偏器垂直的的起偏器）。
③ 使用旋轉載物臺。當載物臺上放入單折射的物質時，無論如何旋轉載物臺，由于兩個偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質時，由于光線通過這類物質時發生偏轉，因此旋轉載物臺便能檢測到這種物體。
④ 配備補償器或相位片；
⑤ 使用無應力物鏡。

三、電子顯微鏡

電子顯微鏡是利用高速運動的電子束來代替光波的一種顯微鏡。光學顯微鏡下只能清楚地觀察大于 0.2 μm 的結構。而小于 0.2 μm 的結構稱為亞顯微結構（submicroscopic structures）或超微結構（ultramicroscopic structures；ultrastructures）。要想看清這些更為細微的結構，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，并且電子束的波長與發射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短。因此電子顯微鏡的分辨率遠高于光學顯微鏡，目前可達 0.2 nm，放大倍數可達 80 萬倍。電子顯微鏡的基本要結構包括鏡筒、真空系統和電源柜三部分。鏡筒主要由電子槍、電子透鏡、樣品架、熒光屏和照相機構等部件，自上而下地裝配成一個柱體；真空系統包括機械真空泵、擴散泵和真空閥門三部分，并通過抽氣管道與鏡筒相聯接；電源柜由高壓發生器、勵磁電流穩流器和各種調節控制單元組成。電子透鏡是電子顯微鏡鏡筒中的關鍵部件。現代電子顯微鏡大多采用電磁透鏡，由穩定的直流勵磁電流通過帶極靴的線圈產生的強磁場使電子聚焦。電子槍的作用是發射并形成速度均勻的電子束，由燈絲（陰極）、柵極和陽極（加速極）構成。陰極管發射的電子通過柵極上的小孔形成射線束，經陽極電壓加速后射向聚光鏡，起到對電子束加速、加壓的作用。使用中加速電壓的穩定度要求不低于萬分之一。電子顯微鏡按結構和用途可分為透射式電子顯微鏡、掃描式電子顯微鏡、反射式電子顯微鏡和發射式電子顯微鏡等。其中生物學研究中使用的是透射式和掃描式電子顯微鏡。前者常用于觀察那些用普通顯微鏡所不能分辨的細微物質結構；后者主要用于觀察固體表面的形貌。

（一）透射式電子顯微鏡

透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）的組件包括：

1. 電子槍 發射電子，由陰極、柵極、陽極組成。
2. 聚光透鏡 即電子透鏡，將電子束聚集，可用于控制照明強度和孔徑角。
3. 樣品室 放置待觀察的樣品，并裝有旋轉臺，用以改變試樣的角度，還有裝配加熱、冷卻等設備。
4. 物鏡 為放大率很高的短距透鏡，作用是放大電子像。物鏡是決定透射電子顯微鏡分辨能力和成像質量的關鍵。
5. 中間鏡 為可變倍的弱透鏡，作用是對電子像進行二次放大。通過調節中間鏡的電流，可選擇物體的像或電子衍射圖來進行放大。
6. 透射鏡 為高倍的強透鏡，用將二次放大后的中間像進一步放大后在熒光屏上成像。
7. 二級真空泵 對樣品室抽真空。
8．照相裝置 用以記錄影像。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，樣品的密度、厚度等都會影響到zui后的成像質量，必須制備更薄的超薄切片，通常為 50～100 nm。所以用透射電子顯微鏡觀察時的樣品需要處理得很薄。通常用薄切片法或冷凍蝕刻法制備：

（1）薄切片法 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式推進樣品切片，切片厚度 20～50 nm，采用重金屬鹽染色，以增大反差。
（2）冷凍蝕刻法 亦稱冰凍斷裂法。將標本置于100?C 的干冰或196?C 的液氮中冰凍后，以冷刀急速斷開標本。斷裂的標本升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結構，稱為蝕刻。蝕刻完成后，向斷面以 45o 角噴涂一層蒸氣鉑，再以90o 角噴涂一層碳，加強反差和強度。然后用次氯酸鈉溶液消化樣品，剝下碳和鉑的膜，稱為復膜，能顯示標本蝕刻面的形態。在電鏡下觀察得到的影像即代表標本中細胞斷裂面處的結構。

（二）掃描式電子顯微鏡

          掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）于 20 世紀 60 年代問世，目前分辨力可達 6～10 nm。其工作原理是由電子槍發射的精細聚焦電子束經兩級聚光鏡、偏轉線圈和物鏡射到樣品上，掃描樣品表面并激發出次級電子，次級電子的產生量與電子束入射角有關，即與樣品的表面結構有關。次級電子經探測體收集后，由閃爍器轉換為光信號，再經光電倍增管和放大器轉變為電信號來控制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結構。掃描電鏡的標本在檢驗前，需進行固定、脫水處理，再噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發出次級電子信號。